酶聯免疫(HRP)ELISA試劑盒技術資料

　　酶聯免疫(ELISA)通用試劑盒是一種通用的酶聯免疫(ELISA)檢測抗原或抗體的試劑盒，含有 ELISA 實驗所必須的通用試劑組份，對反應條件、操作步驟、各試劑的濃度進行了優化，保證了檢測結果的靈敏度和重復性。

　　蛋白檢測酶標試劑盒可用于檢測小鼠、兔或人的抗體。適用于初次接觸 ELISA 技術的實驗者，或者為節省時間并保證檢測結果具有高靈敏和可重復性的科研工作者。

　　1.試劑盒組分

　　1.1. 包被緩沖液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶

　　1.2. BSA 稀釋液/封閉液(10×濃縮) 100ml ×1 瓶

　　1.3. 洗滌緩沖液((20×濃縮)100ml ×1 瓶

　　1.4. TMB 顯色液 100ml ×2 瓶

　　1.5. 終止液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶

　　1.6. HRP 標記抗體：1ml

　　1.6.1 HRP 標記抗人 IgG (H+L) 0.1 mg

　　1.6.2 HRP 標記抗兔 IgG (H+L) 0.1 mg

　　1.6.3 HRP 標記抗鼠 IgG (H+L) 0.1 mg

　　儲存在 2～8°C，有效期 2 年，可以完成 20 塊 96 孔酶標板檢測。

　　2.試劑盒不提供的試劑或耗材

　　2.1. 人、小鼠或兔的一抗

　　2.2. 親和層析純化的未標記捕獲抗體

　　2.3. 酶標板(不建議用組織培養板)

　　2.4. 吸水紙、毛巾或棉布

　　2.5. 蒸餾水或純化水

　　2.5. 移液器試劑瓶等

　　2.6. 多通道排槍和加液槽

　　2.7. 手套

　　2.8. 槍頭

　　3.檢測原理

　　3.1 雜交瘤篩選可以檢測雜交瘤培養液中的特異性抗體，使用適當標記二抗，可以檢測抗原特異性的人、鼠和兔抗體。

　　3.2 檢測抗原或抗體

　　3.2.1 直接 ELISA：是檢測抗原的簡單方法，包被抗原，加標記的檢測抗體。

　　3.2.2 間接抗體 ELISA: 可以檢測抗原或抗體，取決于哪種是未知的。包被抗原，加一抗或含抗體的血清或腹水，常用于檢測動物特異性抗體的水平，也可用于檢測雜交瘤培養上清中的單克隆抗體。

　　3.2.3 雙抗體夾心法：是檢測抗原的一種高度敏感性的方法。用高度純化的抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，檢測抗體可直接標記酶，如果包被抗體和檢測抗體不是來源同種動物，檢測抗體也可不標記，而加針對檢測抗體動物種屬的酶標二抗，此法適用于抗原濃度過低，不能直接包被到酶標板上或者含有未知成分干擾的抗原檢測。

　　4.確定反應條件

　　4.1 雜交瘤篩選

　　用間接 ELISA 方法篩選抗體

　　4.2 檢測抗原或抗體

　　按照推薦的方法和步驟可以滿足大多數實驗的要求，反應時間、溫度和試劑濃度等可以根據實驗需要進行調整每一步都應該進行系統性評價以便獲得最佳的實驗條件。試劑通過倍比稀釋以確定最佳濃度。選擇合適的對照，以確定實驗中存在的問題，發現引起錯誤結果和高本底的原因。確定實驗方案和樣品數量后，可以準備所需要的各種材料和試劑。實驗前，建議所有的試劑恢復到室溫并混勻。4.3 檢測條件概述

　　4.3.1 包被酶標板

　　多種包被條件：抗原或抗體濃度、pH、離子強度、溫度和孵育時間都影響包被效率。此外，結合蛋白的數量與分子量成反比。試劑盒中包被液為優化的磷酸鹽緩沖液，適用于大多數抗原和抗體的包被。微孔板應選擇專用于 ELISA 的酶標板，不建議使用組織培養板。

　　包被時，抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋后加入到酶標板中室溫孵育，盡可能使用最純的抗原或抗體。一般來說 1～10μg/ml 室溫 1 小時能夠包被飽和。為方便，2～8°C過夜可以到滿意的包被效果。包被后，酶標板用 BSA 稀釋/封閉液封閉 5 分鐘，稀釋/封閉液中含 1%BSA，能夠通過封閉未反應部位減少非特異性結合并保護包被上的蛋白質活性。如果暫時不繼續實驗，可以用塑料膜覆蓋酶標板后冷藏保存，需要時再恢復室溫繼續實驗。

　　4.3.2 洗板

　　加標本和酶標抗體后需要洗滌，通過洗滌可以去掉未反應試劑幫助降低本底。滿意的洗滌方法是孔與孔之見均勻一致并且沒有液體的相互污染。洗滌時將板子翻轉并將液體甩掉拍凈。洗滌液中含有 0.05%吐溫-20 以抑制非特異性結合。如果實驗過程中斷，應該將酶標板中加入洗滌液以避免酶標板干燥。

　　4.3.3HRP 標記抗體

　　HRP 標記的抗體作為檢測抗體，與底物反應后，使底物顯色。實驗過程中避免接觸疊氮na，疊氮na可使 HRP 失活。

　　4.3.4 底物

　　使用 TMB 底物，一般來說，產生的顏色與待測物呈正比。

　　4.3.5 對照和標本

　　每次實驗都要包含適當的對照以用于分析檢測體系的效能。定量 ELISA 要以標準品進行比較。每次實驗要設以下對照：

　　4.3.6 本底對照：不加標本，其它試劑都加，可以幫助分析非特異性本底的原因。將實驗結果減去本底以保證實驗之間的可比性。

　　4.3.7 陰性對照：加已知的陰性參考品。

　　4.3.8 閾值對照：加弱陽性參考品用于確定陽性的臨界值。

　　4.3.9 陽性對照：加強陽性參考品以確定最大線性信號。

　　對照和標本都用 BSA 稀釋/封閉液進行稀釋以保證本底，所有實驗最好做雙份。

　　5.試劑配制

　　所有試劑當日配制

　　5.1 1X 包被液：用蒸餾水稀釋濃縮洗滌液(1ml 濃縮包被液+9ml 蒸餾水)

　　注意：如果在 10X 中出現結晶，加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。

　　5.2 1X BSA 稀釋/封閉液:

　　雜交瘤篩選：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(2ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+8ml 蒸餾水)

　　其它檢測：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(5ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+45ml 蒸餾水)

　　注意：如果在 10X 中出現結晶，加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。

　　5.3 1X 洗滌液：

　　濃縮洗滌液 20 倍稀釋(15ml 濃縮洗滌液+285ml 蒸餾水)。稀釋的洗滌液室溫穩定至少

　　6 個月。

　　5.4 二抗工作液：

　　二抗濃縮液濃度為 0.1mg/ml，2～8°C穩定至少 1 年，使用前用 1X BSA 稀釋/封閉液稀釋，對大多數實驗而言，0.1～2.0μg/ml 工作濃度。

　　5.5 TMB 顯色液：直接使用。

　　5.6 終止液：直接使用

　　5.7 標本：

　　5.8 對照

　　6.實驗優化

　　通過 3 個變量來優化 ELISA 條件: 試劑濃度、溫度、孵育時間。一般情況下，室溫反應對大多數實驗能夠得到很好的結果。

　　優化不同試劑濃度和不同孵育時間，選擇最佳的實驗條件。在優化最佳濃度時，第一個試劑倍比稀釋，然后第二個試劑倍比稀釋，每一孔都對應于第一個試劑和第二個試劑的某一個稀釋度的組合。棋盤滴定確定試劑的最佳濃度

　　1.加 100μl 稀釋液到 2～12 列的每孔。

　　2.加 200μl 稀釋的試劑到第一列的每孔中。

　　3.從第 1 列的孔中取 100μl 轉移到第二孔中，混勻用槍吹吸 3～5 次。

　　4. 重復步驟 3 向后稀釋，一直到第 11 列，吸取第 11 列 100μl 棄去， 第 12 列作為對照。

　　重復以上的操作，從 A 排至 G 排, 稀釋第二個試劑，H 排作為對照。

　　7.操作步驟

　　7.1 雜交瘤篩選

　　包被液：在 1×包被液中稀釋抗原至合適的濃度(一般 1～10μg/ml)。

　　一抗工作液：含有單克隆抗體的培養液。

　　二抗工作液：取 25μl 的酶標二抗稀釋到 5.0 ml 1X BSA 的稀釋/封閉液中

　　7.1.1 包被抗原

　　1. 加抗原到酶標板中。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.2 封閉酶標板

　　1.加 150 uL 1X BSA 稀釋/封閉液到每孔中。

　　2. 孵育 5-15 分鐘, 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.3 與含單克隆抗體的培養液反應

　　1.每孔中加 50 uL 含單克隆抗體的培養液。

　　2. 室溫反應 1 小時.

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復 3～5 次。

　　7.1.5 加二抗

　　1. 每孔加 50 uL 二抗。

　　2. 室溫反應 1 小時。e.

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，洗板。

　　4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.6 顯色反應

　　1. 每孔加 50 uL 底物，室溫反應 15 分鐘。

　　2. 每孔加 50ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　7.2 直接 ELISA

　　抗原包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。

　　酶標抗體：稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優化方法。

　　7.2.1 加抗原

　　1. 在酶標板中每孔加入 100μ抗原包被液。

　　2.室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.2 封閉

　　1. 每孔加 300μ1X BSA 稀釋/封閉液。

　　2. 反應 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.3 加酶標抗體

　　1. 每孔加入 100 μl 酶標抗體。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復 3～5 次。

　　4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.5 顯色反應

　　1. 每孔加 50 uL 底物，室溫反應 15 分鐘。

　　2. 每孔加 50ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　7.3 間接抗體 ELISA

　　抗原包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。

　　一抗/二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優化方法。

　　7.3.1 加抗原

　　1. 在酶標板中每孔加入 100μ抗原包被液。

　　2.室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.2 封閉

　　1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。

　　2. 反應 5～15 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.3 加一抗

　　1. 每孔中加入 100μl 一抗

　　2. 室溫反應 1 小時

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復 3～5 次。

　　7.3.5 加二抗

　　1. 每孔加入 100μl 酶標二抗。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 重復 3～5 次。

　　4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.6 顯色反應

　　1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應 15 分鐘。

　　2. 每孔加 100ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　7.4 雙抗體夾心 ELISA

　　包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。

　　抗原標本：將抗原標本稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中。

　　二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優化方法。

　　7.4.1 加捕獲抗體

　　1. 在酶標板中每孔加入 100μ抗體包被液。

　　2.室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.2 封閉

　　1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。

　　2. 反應 5～15 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.3 加抗原

　　1. 每孔中加入 100μl 標本液

　　2. 室溫反應 1 小時直至過夜。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復 3～5 次。

　　7.4.5 加標記抗體1. 每孔加入 100μl 標記。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　4. 重復 3～5 次。

　　5. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.6 顯色反應

　　1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應 15 分鐘。

　　2. 每孔加 100ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　8.可能出現的問題和解決辦法

　　8.1 以下結果表示實驗有效：

　　陰性對照：無色

　　背景對照：OD 值低于 0.2

　　閾值對照：中度顯色

　　強陽性對照：深度顯色，OD≥1.0

　　8.2 希望增加特異性信號

　　1. 增加酶標抗體的濃度或延長孵育時間或提高孵育溫度。

　　2. 延長底物的孵育時間。

　　3. 增加包被抗原濃度或延長孵育時間。

　　4.用純化的抗原。

　　5. 封閉時間縮短或增加 BSA 稀釋/封閉液的稀釋度。

　　6. 減少洗板次數或操作更輕柔。

　　8.3 減少非特異性信號

　　1.減少包被抗原濃度或縮短孵育時間。

　　2.減少酶標抗體的濃度或縮短孵育時間或降低孵育溫度。

　　3.縮短底物的孵育時間。

　　4.增加洗板次數或延長洗滌液浸泡時間。

　　5.通過加低濃度包被抗原或捕獲抗體到稀釋的酶標物中以減少結合物的交叉反應。

　　8.4. 背景忽高忽低，檢查洗板機功能是否正常。